CYP2E1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401357-ACT

Humanes CYP2E1 kodiert eine Cytochrom‑P450‑Monooxygenase, die die Oxidation kleiner, niedermolekularer Substrate katalysiert, darunter Ethanol, Aceton und verschiedene Xenobiotika, und damit die hepatische Stoffwechselkapazität prägt. Über NADPH‑abhängigen Elektronentransfer und die Kopplung an die Redoxhomöostase kann die CYP2E1‑Aktivität reaktive Sauerstoffspezies und Lipidperoxidation erhöhen und steht dadurch in Zusammenhang mit zellulären Stressantworten und inflammatorischer Signalübertragung. CYP2E1 ist in Signalwege des Arzneistoffmetabolismus und der chemischen Karzinogenese eingebunden und wird häufig im Kontext von Leberschädigung, Steatohepatitis und toxinvermittelter Hepatotoxizität untersucht. Variationen in der CYP2E1‑Expression beeinflussen zudem interindividuelle Unterschiede in der Elimination von Xenobiotika sowie in der Bildung von Metaboliten, was für Pharmakologie und die Biologie umweltbedingter Expositionen relevant ist.

CYP2E1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYP2E1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CYP2E1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYP2E1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYP2E1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CYP2E1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYP2E1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CYP2E1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CYP2E1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYP2E1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.