CYP21A2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402919-LAC

CYP21A2 codifica il citocromo P450 21-idrossilasi, una monoossigenasi associata al reticolo endoplasmatico che catalizza passaggi chiave di 21-idrossilazione nella steroidogenesi surrenalica, inclusa la conversione del progesterone e del 17α-idrossiprogesterone verso la biosintesi di mineralcorticoidi e glucocorticoidi. Questo enzima opera nell’ambito della chimica redox dei P450 dipendente dall’eme ed è integrato nelle vie ormonali derivate dal colesterolo che influenzano la zonazione surrenalica, il feedback endocrino e lo stato metabolico cellulare. Un’alterata attività di CYP21A2 è fortemente associata ai fenotipi dell’iperplasia surrenalica congenita e rappresenta un punto d’ingresso molecolare per studiare, in modelli cellulari pertinenti, l’accumulo di precursori steroidei, la produzione alterata di cortisolo/aldosterone e gli effetti a valle sulla segnalazione. Poiché CYP21A2 si trova in una regione genomica complessa vicino al pseudogene altamente omologo CYP21A1P, per gli studi meccanicistici è spesso importante un’analisi precisa della regolazione specifica del locus.

Le particelle di attivazione lentivirale CYP21A2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di CYP21A2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale CYP21A2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione CYP21A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di CYP21A2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo CYP21A2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.