cyclin E CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400105-ACT

Das humane Gen **CCNE1** kodiert Cyclin E, einen zentralen Regulator des G1/S-Übergangs, der mit **CDK2** einen aktiven Kinasekomplex bildet, um die Lizenzierung von DNA-Replikationsursprüngen und den Eintritt in die S‑Phase zu fördern. Die Cyclin‑E–CDK2‑Signalgebung integriert mitogene Signale mit der Checkpoint-Kontrolle, indem sie die Phosphorylierung von Substraten koordiniert, die an **E2F**-abhängiger Transkription, Replikations-Timing und Zentrosomenverdopplung beteiligt sind. Eine fehlregulierte **CCNE1**-Expression stört die Zellzyklus-Treue und Genomstabilität und verknüpft Cyclin‑E‑Aktivität mit Replikationsstress, chromosomaler Instabilität und onkogener Zellproliferation. Entsprechend wird **CCNE1** in menschlichen Modellsystemen breit in Signalwegen untersucht, die den Zellzyklusverlauf, DNA-Schadensantworten und Mechanismen der Kontrolle des Zellwachstums steuern.

cyclin E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCNE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cyclin E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCNE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCNE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cyclin E-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCNE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cyclin E-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cyclin E-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCNE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.