Plásmido CRISPR de Activación (h) CNK1: sc-403355-ACT

CNKSR1 codifica CNK1, una proteína andamiaje multidominio que coordina la propagación de señales desde los receptores tirosina cinasa hacia la cascada RAS–RAF–MEK–ERK y otros programas dependientes de MAPK. Al organizar complejos que contienen quinasas RAF, reguladores de la vía de RAS y componentes del citoesqueleto, CNK1 influye en la proliferación, la diferenciación y la morfología celular, y puede modular la comunicación cruzada con la señalización PI3K/AKT. La función de CNK1 se ha vinculado a un control dependiente del contexto de la señalización oncogénica de RAS, con cambios en la expresión o en el acoplamiento de la vía descritos en múltiples modelos de cáncer. Estas propiedades hacen de CNKSR1 un nodo útil para analizar el cableado de las vías, la regulación por retroalimentación y la especificidad de la señal mediada por andamiajes en células humanas.

CNK1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CNKSR1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CNK1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CNKSR1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CNKSR1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CNK1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CNKSR1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CNK1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CNK1 en células tumorales con expresión de CNKSR1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.