Chk2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400438-ACT

CHEK2 kodiert die humane Checkpoint-Kinase Chk2, eine Serin/Threonin-Kinase, die nach DNA-Doppelstrangbrüchen nachgeschaltet von ATM aktiviert wird. Chk2 leitet die DNA-Schadenssignalgebung weiter, indem es Effektoren phosphoryliert, die Zellzyklus-Checkpoints, DNA-Reparatur, Apoptose und Replikationsstressantworten regulieren, und ist dabei in p53 und andere Netzwerke der Genomüberwachung eingebunden. Über diese Signalwege trägt CHEK2 zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität bei und beeinflusst zelluläre Entscheidungen nach genotoxischem Stress. Eine veränderte CHEK2/Chk2-Signalgebung ist mit gestörter Checkpoint-Kontrolle und einer erhöhten Anfälligkeit für Genominstabilität in zahlreichen Krankheitskontexten assoziiert, was ihre breite Bedeutung für mechanistische Studien unterstreicht.

Chk2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHEK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Chk2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHEK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHEK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Chk2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHEK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Chk2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Chk2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHEK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.