CH25H Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402849-ACT

O gene humano CH25H codifica a colesterol 25-hidroxilase, uma enzima associada ao retículo endoplasmático que converte colesterol em 25-hidroxicolesterol, um oxisterol que modula a homeostase dos esteróis e a sinalização imune inata. A atividade de CH25H interage com programas de biossíntese e transporte de colesterol, incluindo a regulação metabólica dirigida por SREBP, e influencia o controle, mediado por lipídios, da expressão de genes inflamatórios a jusante. Como um fator induzível por interferon em contextos mieloides e epiteliais, CH25H tem sido associado a interações hospedeiro–patógeno e à regulação de respostas de citocinas. A desregulação da sinalização CH25H/25-hidroxicolesterol é relevante para estudos de inflamação metabólica, vias associadas à aterosclerose e alterações imunes observadas em infecções e em fenótipos semelhantes aos autoimunes.

CH25H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CH25H sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CH25H O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CH25H em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CH25H, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CH25H. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CH25H nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CH25H no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CH25H em células tumorais com expressão de CH25H silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.