Plásmido CRISPR de Activación (h) Cdc6: sc-400796-ACT

CDC6 codifica la ATPasa humana Cdc6, un factor esencial de licenciamiento para la replicación del ADN que coopera con ORC y CDT1 para cargar la helicasa MCM2–7 en los orígenes de replicación durante la fase G1. Al coordinar el licenciamiento de los orígenes, Cdc6 ayuda a garantizar que la replicación ocurra una sola vez por ciclo celular y se integra con el control de entrada en fase S, la señalización por estrés replicativo y las vías de puntos de control, incluidas ATR/CHK1. La expresión desregulada de CDC6 puede impulsar un disparo aberrante de orígenes, inestabilidad genómica y una dinámica alterada del ciclo celular, rasgos observados comúnmente en la biología tumoral y otras patologías vinculadas a la proliferación. Como componente central de la maquinaria de inicio de la replicación, CDC6 se estudia con frecuencia en el contexto de las respuestas al daño del ADN, el estrés replicativo inducido por oncogenes y los mecanismos que acoplan el licenciamiento de la replicación al estado de la cromatina.

Cdc6 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CDC6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cdc6 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CDC6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CDC6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cdc6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CDC6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cdc6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cdc6 en células tumorales con expresión de CDC6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.