Plásmido CRISPR de Activación (m) CBS: sc-419496-ACT

El gen Cbs de ratón codifica la cistationina β-sintasa (CBS), una enzima dependiente de fosfato de piridoxal que cataliza la condensación de homocisteína y serina para formar cistationina en la vía de transulfuración. Al controlar el flujo de homocisteína hacia la biosíntesis de cisteína y glutatión, CBS influye en el equilibrio redox celular, la capacidad de metilación y la homeostasis de aminoácidos azufrados, con efectos posteriores sobre el estrés oxidativo y la función mitocondrial. CBS también contribuye a la producción endógena de sulfuro de hidrógeno, vinculando la actividad de Cbs con procesos de señalización que modulan el tono vascular y las respuestas inflamatorias. La desregulación del metabolismo dependiente de CBS se utiliza ampliamente para modelar la fisiopatología asociada a la hiperhomocisteinemia y para investigar las contribuciones metabólicas a fenotipos neurovasculares y hepáticos en sistemas murinos.

CBS El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cbs sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CBS El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cbs en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cbs, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CBS. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cbs y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CBS en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CBS en células tumorales con expresión de Cbs silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.