CA VIII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403750-ACT

O CA8 humano codifica a anidrase carbónica VIII (CA VIII), uma proteína relacionada às anidrases carbónicas, porém acatalítica, que modula a sinalização neuronal em vez da hidratação de CO₂. A CA VIII é altamente enriquecida no sistema nervoso central e regula a dinâmica intracelular do cálcio por meio da interação com vias do recetor de inositol 1,4,5-trifosfato, influenciando a excitabilidade das células de Purkinje e a função sináptica. Alterações na expressão ou na função de CA8 têm sido associadas a fenótipos de neurodesenvolvimento e de coordenação motora, sustentando a sua relevância para os circuitos cerebelares e redes de sinalização dependentes de cálcio. Como membro não enzimático da família CA, a CA VIII também serve como modelo para dissecar papéis do tipo “scaffold” de pseudoenzimas na sinalização celular.

CA VIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CA8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CA VIII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CA8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CA8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CA VIII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CA8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CA VIII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CA VIII em células tumorais com expressão de CA8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.