Plásmido CRISPR de Activación (h) BCKDE1A: sc-417950-ACT

BCKDHA codifica la subunidad E1α del complejo deshidrogenasa de α-cetoácidos de cadena ramificada (BCKDH), un sistema multienzimático mitocondrial que cataliza la descarboxilación oxidativa de α-cetoácidos de cadena ramificada derivados de la leucina, la isoleucina y la valina. Esta reacción es central para el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada y vincula el estado nutricional con la producción de acetil‑CoA/succinil‑CoA, el equilibrio redox mitocondrial y el metabolismo energético celular. La actividad de BCKDH está estrechamente regulada por fosforilación y desfosforilación, integrando señales de BCKDK y PPM1K para modular el flujo metabólico. La desregulación de BCKDHA y el deterioro de la función de BCKDH se asocian con errores innatos del metabolismo y se estudian ampliamente en el contexto de la disfunción mitocondrial y la alteración de la homeostasis de aminoácidos.

BCKDE1A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de BCKDHA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BCKDE1A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus BCKDHA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional BCKDHA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BCKDE1A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo BCKDHA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BCKDE1A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BCKDE1A en células tumorales con expresión de BCKDHA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.