BBS8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404755-ACT

TTC8 kodiert BBS8, eine zentrale Komponente des BBSom-Komplexes, der den Transport von Fracht zur und von der primären Zilie koordiniert und damit die Sortierung von Zilienmembranproteinen sowie intraflagellärtransport-gekoppelte Prozesse unterstützt. Durch die Regulation zilienabhängiger Signalwege, darunter Sonic-Hedgehog- und GPCR-Transport, trägt BBS8 zur Aufrechterhaltung der zellulären Polarität und der sensorischen Signalübertragung in mehreren Geweben bei. Genetische Störungen oder Funktionsdefekte von BBS8 sind mit dem Bardet-Biedl-Syndrom und verwandten Ziliopathien assoziiert, die pleiotrope Phänotypen zeigen, wie sie mit einer beeinträchtigten Zilienstruktur und -signalgebung vereinbar sind. In humanen Zellmodellen bietet die gezielte Veränderung der TTC8-Expression einen gut handhabbaren Ansatz, um ziliäre Proteostase, vesikulären Transport und die Umprogrammierung von Signalwegen infolge veränderter ziliärer Signalgebung zu untersuchen.

BBS8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TTC8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BBS8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TTC8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TTC8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BBS8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TTC8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BBS8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BBS8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TTC8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.