BBS4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403421-ACT

BBS4 kodiert eine zentrale Komponente des BBSoms, eines Multiproteinkomplexes, der den Transport von Membranrezeptoren und Signalproteinen zum und vom primären Zilium vermittelt. Durch die Koordination des intraflagellären Transports und der Zusammensetzung der zilienären Membran unterstützt BBS4 die Ziliogenese und reguliert ziliumabhängige Signalwege, darunter Hedgehog und andere GPCR-gekoppelte Signalnetzwerke. Eine Störung von BBS4 beeinträchtigt die Dynamik der zilienären Signalübertragung und die zelluläre Homöostase in ziliierten Geweben. Varianten in BBS4 sind mit dem Bardet–Biedl-Syndrom assoziiert und verknüpfen veränderten zilienären Transport mit Multisystem-Phänotypen, die für die Forschung zur Neuroentwicklung sowie zur Stoffwechsel- und Sinnesbiologie relevant sind.

BBS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BBS4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BBS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BBS4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BBS4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BBS4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BBS4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BBS4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BBS4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BBS4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.