Plásmido CRISPR de Activación (h) ATP13A2: sc-404770-ACT

ATP13A2 codifica una ATPasa lisosomal de tipo P5 implicada en el mantenimiento de la homeostasis endolisosomal, incluida la función de la membrana lisosomal, el manejo de cationes y poliaminas, y el tráfico vesicular. Al apoyar el control de calidad dependiente de los lisosomas, ATP13A2 influye en el flujo autofagia–lisosoma y en las vías de proteostasis que se entrecruzan con las respuestas al estrés mitocondrial y al daño oxidativo. La alteración o desregulación de ATP13A2 se ha vinculado a fenotipos neurodegenerativos, con asociaciones recurrentes con parkinsonismo de inicio juvenil y con defectos similares a los de las enfermedades de almacenamiento lisosomal observados en modelos celulares. Como resultado, ATP13A2 se estudia ampliamente por su papel en la vulnerabilidad neuronal, la eliminación de proteínas propensas a agregarse y las redes de señalización endolisosomal.

ATP13A2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP13A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ATP13A2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP13A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP13A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ATP13A2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP13A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ATP13A2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ATP13A2 en células tumorales con expresión de ATP13A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.