Plásmido CRISPR de Activación (h) ASS1: sc-401923-ACT

ASS1 humano (argininosuccinato sintasa 1) codifica una enzima citosólica que cataliza la condensación dependiente de ATP de citrulina y aspartato para formar argininosuccinato, un paso central del ciclo de la urea y de la biosíntesis de arginina. Al regular la eliminación de nitrógeno y la disponibilidad de arginina, ASS1 influye en la homeostasis celular de aminoácidos, el metabolismo del óxido nítrico y la síntesis posterior de poliaminas. La expresión alterada de ASS1 se asocia con disfunción hereditaria del ciclo de la urea y puede remodelar las dependencias metabólicas en células tumorales, donde con frecuencia se observan auxotrofía de arginina y una reprogramación del metabolismo de un carbono y de nucleótidos. Estas características hacen de ASS1 un nodo útil para estudiar la regulación de vías metabólicas, las respuestas al estrés por nutrientes y las relaciones genotipo–fenotipo en modelos celulares humanos.

ASS1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ASS1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ASS1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ASS1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ASS1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ASS1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ASS1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ASS1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ASS1 en células tumorales con expresión de ASS1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.