ARD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402395-ACT

NAA10 kodiert ARD1, die katalytische Untereinheit des NatA‑N‑terminalen Acetyltransferase‑Komplexes, der entstehende Polypeptide co‑translational N‑terminal acetyliert und dadurch Protein-Stabilität, -Lokalisation und -Interaktionen moduliert. Über die N‑terminale Acetylierung beeinflusst ARD1 die Proteostase, die Zytoskelettdynamik und stressresponsive Signalwege und ist in Pfade eingebunden, die Zellwachstum und Überleben regulieren. Eine veränderte NAA10/ARD1‑Aktivität wurde mit dysregulierten Transkriptionsprogrammen und gestörter Proteinhomöostase in Verbindung gebracht, was sie mit Entwicklungsphänotypen und krebsrelevanten zellulären Verhaltensweisen verknüpft. Als Regulator der Proteinacetylierung wird ARD1 häufig im Zusammenhang mit translationsgekoppelter Qualitätskontrolle und einer epigenetikähnlichen Steuerung der Proteinfunktion untersucht.

ARD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NAA10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ARD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NAA10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NAA10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ARD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NAA10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ARD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ARD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NAA10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.