Plásmido CRISPR de Activación (h) APOBEC3A: sc-418267-ACT

La APOBEC3A humana codifica una desaminasa de citidina dependiente de zinc de la familia APOBEC que cataliza la edición C→U en ADN monocatenario y puede influir en la estabilidad del genoma durante el estrés replicativo. Participa en la defensa antiviral innata y se interrelaciona con procesos de respuesta al daño del ADN y de reparación, incluidas vías vinculadas al procesamiento de horquillas de replicación y a la mutagénesis. La actividad desregulada de APOBEC3A se ha asociado con firmas mutacionales características de desaminación de citidina observadas en múltiples tipos de cáncer y con contextos inflamatorios que aumentan los sustratos de ADN monocatenario. Como resultado, APOBEC3A se estudia ampliamente por sus funciones en las interacciones huésped–patógeno, la restricción de retroelementos endógenos y los mecanismos que modelan los paisajes de mutación somática.

APOBEC3A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de APOBEC3A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

APOBEC3A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus APOBEC3A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional APOBEC3A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de APOBEC3A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo APOBEC3A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de APOBEC3A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía APOBEC3A en células tumorales con expresión de APOBEC3A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.