ANO2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404198-ACT

O ANO2 humano (anoctamina 2/TMEM16B) codifica um canal de cloreto ativado por cálcio que regula a excitabilidade de membrana e a homeostase iónica em células eletricamente responsivas. A atividade do ANO2 acopla sinais intracelulares de Ca2+ ao fluxo de cloreto, moldando a despolarização evocada por estímulos, os pós-potenciais e a adaptação do sinal, particularmente em contextos sensoriais e neuronais. Por meio desses processos, o ANO2 contribui para redes de sinalização dependentes de Ca2+ que influenciam a neurotransmissão, a transdução sensorial e respostas celulares dependentes de atividade. Alterações na condutância de cloreto da família das anoctaminas têm sido associadas à excitabilidade desregulada e à disfunção sensorial, tornando o ANO2 um alvo relevante para estudos mecanísticos de biologia de canais e sinalização acoplada ao Ca2+.

ANO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ANO2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANO2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ANO2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ANO2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANO2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ANO2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANO2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANO2 em células tumorais com expressão de ANO2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.