AKAP 79 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402647-ACT

O gene humano AKAP5 codifica a proteína de ancoragem da A-quinase 79 (AKAP 79), uma proteína de andaime associada à membrana que organiza espacialmente a PKA juntamente com enzimas-chave de sinalização, incluindo PP2B/calcineurina e PKC, para modular a fosforilação dependente de estímulos. Ao ancorar esses complexos próximos a receptores e canais iônicos, a AKAP 79 regula a sinalização compartimentalizada dependente de cAMP e de Ca2+, a plasticidade sináptica e a remodelação dependente de atividade de sinapses excitatórias. A sinalização associada à AKAP 79 influencia a função dos receptores AMPA e NMDA e programas transcricionais a jusante que controlam a excitabilidade neuronal. A desregulação de centros de sinalização ligados à AKAP5 tem sido implicada em mecanismos de doenças neurológicas e psiquiátricas, nos quais alterações na sinalização sináptica e no equilíbrio das vias de Ca2+/cAMP contribuem para a fisiopatologia.

AKAP 79 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AKAP5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AKAP 79 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AKAP5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AKAP5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AKAP 79. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AKAP5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AKAP 79 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AKAP 79 em células tumorais com expressão de AKAP5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.