Plásmido CRISPR de Activación (h) AKAP 79: sc-402647-ACT

El AKAP5 humano codifica la proteína de anclaje de la proteína quinasa A 79 (AKAP 79), una proteína andamiaje asociada a membrana que organiza espacialmente la PKA junto con enzimas de señalización clave, incluidas PP2B/calcineurina y PKC, para modular la fosforilación dependiente del estímulo. Al anclar estos complejos cerca de receptores y canales iónicos, AKAP 79 regula la señalización compartimentalizada dependiente de AMPc y de Ca2+, la plasticidad sináptica y la remodelación dependiente de la actividad de las sinapsis excitadoras. La señalización asociada a AKAP 79 influye en la función de los receptores AMPA y NMDA y en programas transcripcionales posteriores que controlan la excitabilidad neuronal. La desregulación de los centros de señalización vinculados a AKAP5 se ha implicado en mecanismos de enfermedades neurológicas y psiquiátricas, en las que la alteración de la señalización sináptica y del equilibrio de las vías de Ca2+/AMPc contribuye a la fisiopatología.

AKAP 79 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AKAP5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AKAP 79 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AKAP5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AKAP5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AKAP 79. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AKAP5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AKAP 79 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AKAP 79 en células tumorales con expresión de AKAP5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.