Plásmido CRISPR de Activación (m) AHNAK: sc-425992-ACT

Ahnak codifica AHNAK, una gran proteína de andamiaje que se localiza en la membrana plasmática, el citoesqueleto y el núcleo, donde coordina el ensamblaje de complejos proteicos y la integración de señales. En células de ratón, AHNAK se ha vinculado con la regulación de la remodelación de actina, la adhesión y migración celular, y la dinámica de reparación de membrana, con efectos posteriores sobre la señalización dependiente de calcio y las vías de quinasas implicadas en respuestas celulares al estrés. Mediante interacciones con complejos asociados a membrana y reguladores del citoesqueleto, AHNAK influye en el comportamiento de células epiteliales e inmunitarias, incluidos cambios en la polaridad, la motilidad y las propiedades de barrera. La expresión o localización desregulada de AHNAK se ha asociado con fenotipos proliferativos y migratorios alterados, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos en biología del cáncer, inflamación y modelos de remodelación tisular.

AHNAK El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ahnak sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AHNAK El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ahnak en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ahnak, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AHNAK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ahnak y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AHNAK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AHNAK en células tumorales con expresión de Ahnak silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.