ABCA4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401830-ACT

ABCA4 kodiert einen ATP-bindenden Kassetten-(ABC)-Transporter, der überwiegend in retinalen Photorezeptoren exprimiert wird, wo er in den Discmembranen der Außensegmente lokalisiert ist und im visuellen Zyklus eine Funktion erfüllt. ABCA4 vermittelt den ATP-abhängigen Transport von Retinoid-Konjugaten und hilft dabei, N‑Retinyliden‑Phosphatidylethanolamin und verwandte Zwischenprodukte zu entfernen, um die Anreicherung zytotoxischer Bisretinoide wie A2E zu begrenzen. Durch seine Rolle in der Retinoidverarbeitung unterstützt ABCA4 die Homöostase der Photorezeptoren und ist mit Signalwegen verknüpft, die den Lipidtransport, oxidativen Stress sowie Interaktionen zwischen retinalem Pigmentepithel und Photorezeptoren steuern. Eine Dysregulation oder verminderte Aktivität von ABCA4 ist stark mit erblichen Netzhautdegenerationen assoziiert, darunter die Stargardt-Krankheit und die ABCA4-assoziierte Zapfen-Stäbchen-Dystrophie, was ABCA4 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien der retinalen Pathobiologie macht.

ABCA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABCA4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABCA4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABCA4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABCA4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.