20S Proteasome α3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401857-ACT

PSMA3 codifica la subunità α3 del proteasoma 20S, un componente centrale del barile catalitico 20S che costituisce il fulcro proteolitico del sistema ubiquitina–proteasoma. Supportando l’assemblaggio del proteasoma 26S e la degradazione regolata di proteine a breve emivita e mal ripiegate, la subunità α3 contribuisce a mantenere la proteostasi e modula le reti di segnalazione che controllano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e la trascrizione adattativa allo stress. L’attività del proteasoma influisce anche sull’elaborazione degli antigeni per la presentazione tramite MHC di classe I e sul turnover di effettori di via, come i regolatori di NF-κB, collegando così la funzione di PSMA3 all’infiammazione e alla sorveglianza immunitaria. Una capacità proteasomiale e una composizione delle subunità deregolate sono associate alla fitness delle cellule tumorali, alle proteinopatie neurodegenerative e a risposte alterate allo stress ossidativo o del reticolo endoplasmatico (ER), rendendo PSMA3 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla biologia delle malattie guidate dalla proteostasi.

20S Proteasome α3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSMA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

20S Proteasome α3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSMA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSMA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 20S Proteasome α3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSMA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 20S Proteasome α3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 20S Proteasome α3 nelle cellule tumorali con espressione di PSMA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.