λ-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412108-ACT

CRYL1 codifica a λ-cristalina, uma enzima citosólica dependente de NADPH com atividade de L-gulonato 3-desidrogenase, que conecta o metabolismo de carboidratos à homeostase redox celular. Ao modular o uso de NADPH, a CRYL1 pode influenciar as respostas ao estresse oxidativo e o fluxo metabólico por vias ligadas à rede da via das pentoses fosfato e a intermediários relacionados de ácidos de açúcar. A expressão de CRYL1 tem sido estudada no contexto da especialização metabólica específica de tecidos e da adaptação celular à disponibilidade de nutrientes. A desregulação do controle redox e metabólico envolvendo processos associados à CRYL1 tem sido investigada em modelos relevantes para doenças, nos quais o estresse oxidativo e alterações no metabolismo intermediário contribuem para a patologia.

λ-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

λ-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de λ-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de λ-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via λ-crystallin em células tumorais com expressão de CRYL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.