αA-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402047-ACT

CRYAA codifica a αA-cristalina humana, uma pequena proteína de choque térmico que atua como chaperona molecular independente de ATP para manter a proteostase, prevenindo a agregação de proteínas parcialmente desenoveladas. Altamente expressa no cristalino ocular, a αA-cristalina também contribui para a organização do citoesqueleto, a tolerância ao estresse e a regulação da apoptose por meio de interações com proteínas clientes e outras redes de chaperonas. A atividade de CRYAA está ligada às respostas celulares ao estresse oxidativo e a vias de controle de qualidade de proteínas, críticas para manter a transparência do cristalino. A desregulação ou mutações em CRYAA estão associadas a fenótipos de agregação proteica e têm sido implicadas na patologia molecular relacionada à catarata e, de forma mais ampla, na biologia das respostas ao estresse.

αA-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYAA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

αA-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYAA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYAA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de αA-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYAA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de αA-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via αA-crystallin em células tumorais com expressão de CRYAA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.