Wnt-7b CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423722-ACT

Wnt7b kodiert für das sezernierte Glykoprotein Wnt-7b, einen zentralen Liganden der kanonischen und nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung, der während der Entwicklung die Festlegung von Zellschicksalen, Proliferation und Gewebemusterbildung reguliert. In der Maus trägt die Wnt-7b-Aktivität zur Organogenese und zur epithelial-mesenchymalen Signalübertragung bei und beeinflusst dabei Prozesse wie Angiogenese, Verzweigungsmorphogenese und Knochenremodellierung über β-Catenin-abhängige transkriptionelle Programme. Eine fehlregulierte Wnt-7b/Wnt-Signalgebung ist mit aberranter Differenzierung und Remodelling-Phänotypen assoziiert, die für Entwicklungsstörungen, fibroseassoziierte Gewebeveränderungen und die Krebsbiologie relevant sind. Als Signalhinweis wird Wnt-7b häufig genutzt, um kontextspezifische transkriptionelle Netzwerke und Morphogengradienten in vivo und in kultivierten Zellsystemen zu untersuchen.

Wnt-7b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wnt7b-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-7b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wnt7b-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wnt7b-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-7b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wnt7b-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-7b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-7b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wnt7b-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.