WIF-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402389-ACT

WIF1 kodiert den Wnt-Inhibitor-Faktor 1 (WIF-1), einen sezernierten extrazellulären Antagonisten, der an WNT-Liganden bindet und deren Bindung an Rezeptoren begrenzt. Dadurch werden kanonische β‑Catenin/TCF-Transkriptionsprogramme sowie damit verbundene nichtkanonische Wnt-Signalausgänge abgeschwächt. Indem WIF-1 die Wnt-gesteuerte Kontrolle von Proliferation, Differenzierung und Gewebemusterbildung einschränkt, trägt es zur Regulation des Verhaltens von Stamm-/Vorläuferzellen und extrazellulärer Signalgradienten bei. Eine verminderte WIF1-Expression ist in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten häufig mit aberranter Wnt-Signalwegaktivität und veränderten epithelial-mesenchymalen Eigenschaften assoziiert, darunter onkogene Transformation und fibrotisches Remodelling. Als Modulator der Ligandenverfügbarkeit wird WIF-1 häufig im Rahmen von Signalweg-Crosstalk mit Hedgehog-, TGF‑β- und inflammatorischen Signalnetzwerken untersucht, die auf Zellschicksal und Matrixhomöostase zusammenlaufen.

WIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WIF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WIF-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WIF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WIF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WIF-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WIF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WIF-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WIF-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WIF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.