VSTM3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404147-ACT

TIGIT, auch bekannt als VSTM3, kodiert einen inhibitorischen Immunrezeptor, der auf aktivierten T‑Zellen, regulatorischen T‑Zellen und NK‑Zellen exprimiert wird und zur Aufrechterhaltung der Immunhomöostase beiträgt. Durch die Bindung an Liganden der Poliovirus-Rezeptorfamilie wie PVR (CD155) und PVRL2 (CD112) moduliert TIGIT eine ITIM‑ähnliche Signalübertragung und wirkt kostimulatorischen Signalwegen entgegen. Dadurch beeinflusst es Zytotoxizität, Zytokinproduktion und die Funktion der immunologischen Synapse. Eine veränderte TIGIT-Signalgebung wird mit Immunflucht und gestörter antitumoraler Immunität sowie mit chronischen Entzündungs- und Autoimmunprozessen in Verbindung gebracht und macht TIGIT zu einem zentralen Knotenpunkt der Checkpoint-Biologie. Als Oberflächenrezeptor, der Adhäsions- und inhibitorische Signale integriert, bietet TIGIT einen mechanistischen Zugang zur Untersuchung von Rezeptor‑Ligand‑Interaktionen, Transkriptionsprogrammen erschöpfter Lymphozyten und der Wechselwirkung mit der CD226/DNAM‑1‑Signalgebung.

VSTM3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TIGIT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VSTM3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TIGIT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TIGIT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VSTM3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TIGIT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VSTM3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VSTM3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TIGIT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.