VPS26B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410249-ACT

VPS26B kodiert eine zentrale Komponente des Retromer-Komplexes, der die Sortierung endosomaler Fracht sowie deren Recycling von Endosomen zum trans-Golgi-Netzwerk und zur Plasmamembran steuert. In Zusammenarbeit mit VPS35 und VPS29 trägt VPS26B zur Aufrechterhaltung der Homöostase von Membranproteinen bei, reguliert den Rezeptortransport und unterstützt die lysosomale Funktion, indem es eine fehlgeleitete Endosomenreifung begrenzt. Retromer-abhängige Signalwege beeinflussen die zelluläre Signalübertragung, die Lokalisation von Nährstofftransportern und die intrazelluläre Proteostase und verknüpfen die Aktivität von VPS26B mit übergeordneten Prozessen wie Autophagie und endolysosomalen Stressantworten. Eine Dysregulation des endosomalen Traffickings und der Retromer-Funktion wird mit neurodegenerativen und entwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch VPS26B ein relevantes Ziel für mechanistische Studien zur Krankheitsbiologie im Zusammenhang mit Membrantransport darstellt.

VPS26B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VPS26B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VPS26B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VPS26B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VPS26B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VPS26B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VPS26B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VPS26B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VPS26B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VPS26B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.