VPRBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403283-ACT

Humanes DCAF1, auch bekannt als VPRBP, kodiert einen Substratrezeptor für den CUL4–DDB1-E3-Ubiquitin-Ligasekomplex, der die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau verschiedenster nukleärer Proteine steuert. Über diese Adapterfunktion hilft VPRBP, die Lizenzierung der DNA-Replikation, die Chromatinregulation, DNA-Schadensantworten und den Zellzyklusfortschritt zu koordinieren und verknüpft damit ubiquitinvermittelte Proteostase mit der transkriptionellen Kontrolle. VPRBP wurde außerdem mit Signalweg-Crosstalk mit Kinasen sowie mit Immun- und Stressantwortprogrammen in Verbindung gebracht, und zwar über den regulierten Abbau von Signalwegkomponenten. Eine Fehlregulation der DCAF1/VPRBP-abhängigen Ubiquitinierung ist mit veränderter Proliferation und Genomstabilität assoziiert, was DCAF1/VPRBP zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung onkogener Signalgebung, chromatinabhängiger Genregulation und Wirt–Pathogen-Interaktionen macht.

VPRBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DCAF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VPRBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DCAF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DCAF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VPRBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DCAF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VPRBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VPRBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DCAF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.