vinculin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400227-ACT

ヒトVCLはビンキュリン（vinculin）をコードしており、機械刺激に応答するアクチン結合性アダプタータンパク質である。ビンキュリンは、インテグリンおよびカドヘリン複合体をアクチン細胞骨格に連結する役割を担い、フォーカルアドヒージョン（接着斑）やアドヘレンスジャンクション（接着結合）に豊富に存在する。ビンキュリンは、タリン、パキシリン、FAK/Srcシグナル伝達、RhoファミリーGTPaseなどが関与する経路を介して、細胞‐ECM接着および細胞‐細胞接着の動態、力の伝達、ならびに細胞骨格リモデリングを制御する。接着のターンオーバーと牽引力を調節することで、VCLは細胞移動、極性、組織形態形成に影響を及ぼし、その破綻は浸潤性や転移能の変化といった文脈で研究されている。VCL依存的なメカノトランスダクションは、心筋細胞の接着や収縮連結のモデルにおいても重要であり、接合部の完全性の変化がストレス応答に影響し得る。

vinculin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性VCLの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

vinculin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における VCL 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はVCL転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性vinculinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のVCL遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるvinculin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびVCL発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるvinculin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。