USP20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406849-ACT

Humanes USP20 kodiert ein deubiquitinierendes Enzym (Ubiquitin-spezifische Protease 20), das Ubiquitinketten von Substratproteinen entfernt und dadurch deren Stabilität, Lokalisation und Signaloutput moduliert. Durch die Regulation des ubiquitinabhängigen Proteinabbaus beeinflusst USP20 unter anderem Prozesse wie Rezeptor-Trafficking, inflammatorische Signaltransduktion und Stressantwortwege, die Zellwachstum und Überleben mitbestimmen. Veränderte Deubiquitinierungsdynamiken unter Beteiligung von USP20 wurden in der Literatur mit fehlregulierten Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die für onkogene Transformation, Immunregulation und metabolische Dysfunktion relevant sind, wodurch USP20 ein nützlicher Knotenpunkt für mechanistische Studien der Proteostase ist. Die Profilierung der USP20-Funktion kann daher dazu beitragen zu klären, wie Ubiquitin-Editing in menschlichen Zellen die Stärke und Dauer von Signalwegen feinabstimmt.

USP20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USP20-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

USP20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USP20-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USP20-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen USP20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USP20-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von USP20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des USP20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USP20-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.