ULK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400516-ACT

ULK1 (quinase 1 ativadora de autofagia do tipo UNC-51) é uma quinase de serina/treonina que inicia a macroautofagia ao integrar sinais de nutrientes e de energia. Atua no núcleo do complexo ULK1 para promover a formação do fagóforo e coordena a maquinaria de autofagia a jusante em resposta à inibição de mTORC1 e à ativação de AMPK. Por meio da regulação do fluxo autofágico, ULK1 influencia a homeostase mitocondrial, a proteostase e a adaptação celular ao estresse metabólico. A desregulação da sinalização de ULK1 e do controle da autofagia está implicada em contextos como neurodegeneração, biologia de infecções e respostas ao estresse em células cancerosas, nos quais a capacidade catabólica alterada pode remodelar vias de sobrevivência.

ULK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ULK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ULK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ULK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ULK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ULK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ULK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ULK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ULK1 em células tumorais com expressão de ULK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.