ULK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400516-ACT

ULK1 (UNC-51 like autophagy activating kinase 1) è una chinasi serina/treonina che avvia la macroautofagia integrando i segnali di nutrienti ed energia. Agisce come componente centrale del complesso ULK1 per promuovere la formazione del fagoforo e coordina i meccanismi autofagici a valle in risposta all’inibizione di mTORC1 e all’attivazione di AMPK. Attraverso la regolazione del flusso autofagico, ULK1 influenza l’omeostasi mitocondriale, la proteostasi e l’adattamento cellulare allo stress metabolico. La deregolazione della segnalazione di ULK1 e del controllo dell’autofagia è implicata in contesti quali neurodegenerazione, biologia delle infezioni e risposte allo stress delle cellule tumorali, in cui una capacità catabolica alterata può rimodellare le vie di sopravvivenza.

ULK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ULK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ULK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ULK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ULK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ULK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ULK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ULK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ULK1 nelle cellule tumorali con espressione di ULK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.