UCP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417530-ACT

Das humane Gen SLC25A27 kodiert das Entkopplungsprotein 4 (UCP4), einen Carrier der inneren Mitochondrienmembran, der die Protonenleitfähigkeit moduliert, um die Effizienz der oxidativen Phosphorylierung und das mitochondriale Membranpotenzial fein abzustimmen. Die UCP4-Aktivität beeinflusst die zelluläre Energiebilanz, den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies und einen stressadaptiven Stoffwechsel, insbesondere in Geweben mit hohem bioenergetischem Bedarf. Durch seine Wirkung auf die mitochondriale Kopplung und die Redoxhomöostase wird UCP4 in Signalwegen untersucht, die mit neuronaler Widerstandsfähigkeit, bioenergetischem Versagen und entzündungsassoziierter metabolischer Umprogrammierung in Zusammenhang stehen. Eine veränderte UCP4-Expression wurde mit Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration und andere Erkrankungen relevant sind, die durch eine beeinträchtigte mitochondriale Energiebereitstellung gekennzeichnet sind.

UCP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC25A27-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UCP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC25A27-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC25A27-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UCP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC25A27-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UCP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UCP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC25A27-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.