UBPY Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403737-ACT

O USP8 humano codifica a enzima desubiquitinante UBPY, uma protease específica de ubiquitina que edita cadeias de ubiquitina em componentes do tráfego endocítico e em substratos de receptores para controlar a estabilidade e a triagem de proteínas. A UBPY atua no sistema endossomal em coordenação com a maquinaria associada ao ESCRT, regulando a desubiquitinação de cargas, a reciclagem de receptores versus a degradação lisossomal e a amplitude da sinalização a jusante. Por meio dessas atividades, o USP8 influencia vias ligadas à sinalização de receptores de fatores de crescimento, ao transporte vesicular e à proteostase, que frequentemente estão implicadas em sinalização celular desregulada e em função endolisossomal alterada. Estudos genéticos e funcionais conectaram a perturbação de USP8 a fenótipos relevantes para doenças, envolvendo renovação aberrante de receptores e reconfiguração de redes de sinalização, sustentando sua utilidade como um nó mecanístico na pesquisa de homeostase celular.

UBPY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de USP8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UBPY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus USP8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição USP8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UBPY. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus USP8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UBPY no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UBPY em células tumorais com expressão de USP8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.