UBE2D4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405030-ACT

UBE2D4 kodiert ein menschliches Ubiquitin-konjugierendes E2-Enzym, das mit E3-Ligasen zusammenarbeitet, um Ubiquitin an Substratproteine zu koppeln und so deren Stabilität, Lokalisation und Signalweiterleitung zu beeinflussen. Über seine Funktion im Ubiquitin-Proteasom-System trägt UBE2D4 zu einem regulierten Proteinabbau bei, der den Zellzyklus, DNA-Schadensantworten und die Proteostase unter Stress mitsteuert. Störungen in Ubiquitinierungsnetzwerken stehen mit veränderter Signaltreue und der Anreicherung fehlgefalteter oder aberranter Proteine in Zusammenhang – Prozesse, die häufig mit Krebsbiologie und Neurodegeneration verknüpft sind. Als E2-Komponente mit breiter E3-Kompatibilität ist UBE2D4 hilfreich, um pathwayspezifische Ubiquitinierungsereignisse zu analysieren und Substrate zu identifizieren, die zentrale regulatorische Knotenpunkte kontrollieren.

UBE2D4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2D4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBE2D4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2D4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2D4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBE2D4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2D4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBE2D4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBE2D4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2D4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.