Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBE2D4: sc-405030-ACT

UBE2D4 code une enzyme humaine de conjugaison de l’ubiquitine de type E2 qui coopère avec des ligases E3 pour fixer l’ubiquitine à des protéines substrats, modulant ainsi leur stabilité, leur localisation et leurs sorties de signalisation. Par son rôle dans le système ubiquitine–protéasome, UBE2D4 contribue à un renouvellement protéique régulé, qui influence la progression du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et la protéostasie en situation de stress. Des perturbations des réseaux d’ubiquitination sont associées à une altération de la fidélité de la signalisation et à l’accumulation de protéines mal repliées ou anormales, des processus fréquemment impliqués en cancérologie et dans les maladies neurodégénératives. En tant que composant E2 compatible avec un large éventail de ligases E3, UBE2D4 est utile pour disséquer des événements d’ubiquitination spécifiques de certaines voies et identifier des substrats qui contrôlent des nœuds régulateurs clés.

UBE2D4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2D4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBE2D4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2D4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2D4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBE2D4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2D4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBE2D4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBE2D4 dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2D4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.