Plásmido CRISPR de Activación (h) Type II 4-phosphatase: sc-402205-ACT

INPP4B codifica la fosfatasa de polifosfato de inositol 4 tipo II B, una fosfatasa lipídica que hidroliza el fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato a fosfatidilinositol 3-fosfato, moldeando así la composición de fosfoinosítidos en las membranas celulares. A través de esta actividad, INPP4B influye en la transducción de señales PI3K/AKT, el tráfico endosomal y procesos asociados al citoesqueleto que controlan la proliferación, la supervivencia y la migración. La alteración de la expresión de INPP4B o del contexto de la vía se ha asociado con una señalización de fosfoinosítidos desregulada en múltiples escenarios relevantes para enfermedades, incluida la biología del cáncer y la señalización metabólica. Como regulador de nodos de señalización próximos a la membrana, INPP4B se examina con frecuencia por sus efectos sobre la amplitud de la vía, el control por retroalimentación y las transiciones de estado celular.

Type II 4-phosphatase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de INPP4B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Type II 4-phosphatase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus INPP4B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional INPP4B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Type II 4-phosphatase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo INPP4B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Type II 4-phosphatase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Type II 4-phosphatase en células tumorales con expresión de INPP4B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.