Type I 4-phosphatase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404750-ACT

INPP4A codifica a 4-fosfatase tipo I, uma fosfatase lipídica que hidrolisa o fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato em fosfatidilinositol 3-fosfato, moldando assim os reservatórios de fosfoinositídeos que regulam o tráfego de membranas e a transdução de sinais. Ao modular o recrutamento, dependente de PtdIns(3,4)P2, de proteínas com domínio de homologia à plecstrina, a INPP4A influencia a dinâmica da sinalização PI3K/AKT, o tráfego endocítico e cascatas de fosforilação a jusante que afetam programas de crescimento e sobrevivência celular. Alterações na expressão ou na atividade de INPP4A têm sido associadas à desregulação da sinalização por fosfoinositídeos observada em diversos contextos relacionados a doenças, incluindo biologia tumoral e fenótipos neurológicos, tornando-a relevante para estudos mecanísticos de reprogramação de vias.

Type I 4-phosphatase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INPP4A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Type I 4-phosphatase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INPP4A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INPP4A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Type I 4-phosphatase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INPP4A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Type I 4-phosphatase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Type I 4-phosphatase em células tumorais com expressão de INPP4A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.