Plasmide CRISPR d'Activation (h) Twinkle: sc-404159-ACT

Le gène humain **TWNK** code **Twinkle**, une hélicase de l’ADN localisée dans les mitochondries, indispensable à la réplication et au maintien de l’ADN mitochondrial (ADNmt). Twinkle agit avec **POLG** et la **SSB mitochondriale** pour dérouler l’ADNmt double brin au cours de la progression du replisome, soutenant ainsi l’expression des gènes mitochondriaux et la capacité de phosphorylation oxydative. Une perturbation de **TWNK** affecte le nombre de copies et l’intégrité de l’ADNmt, reliant le dysfonctionnement de Twinkle à l’instabilité du génome mitochondrial, à des altérations de la bioénergétique et aux réponses cellulaires au stress. Ces processus sont pertinents pour l’étude de phénotypes neuromusculaires et métaboliques dus à un maintien défaillant de l’ADN mitochondrial.

Twinkle Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TWNK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Twinkle Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TWNK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TWNK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Twinkle. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TWNK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Twinkle au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Twinkle dans les cellules tumorales présentant une expression de TWNK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.