Tropomyosin β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401580-ACT

TPM2 kodiert das humane Tropomyosin beta, ein aktinbindendes Coiled-Coil-Protein, das entlang von filamentösem Aktin polymerisiert und so die Stabilität der dünnen Filamente sowie den Zugang von Myosinmotoren zu Aktin reguliert. Durch die Modulation der Aktomyosin-Kontraktilität trägt Tropomyosin beta zur Organisation des Zytoskeletts, zur Dynamik von Sarkomeren und Stressfasern sowie zu Signalwegen bei, die Zellform, Migration und Mechanotransduktion steuern. Die TPM2-Expression und das Gleichgewicht der Isoformen beeinflussen die Spezialisierung von Aktinfilamenten in Muskel- und Nichtmuskelzellen und verknüpfen TPM2 mit Prozessen wie der Myofibrillogenese und dem zytoskelettalen Remodeling. Genetische Veränderungen in TPM2 wurden mit kongenitalen Myopathien und Kontraktur-Phänotypen in Verbindung gebracht, was TPM2 zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung der Aktinfilament-Regulation in krankheitsrelevanten Zellmodellen macht.

Tropomyosin β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tropomyosin β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tropomyosin β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tropomyosin β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tropomyosin β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.