TPPP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405957-ACT

Humanes TPPP (tubulin polymerization promoting protein) kodiert einen mikrotubuliassoziierten Faktor, der an Tubulin bindet und die Polymerisation sowie Bündelung von Mikrotubuli fördert und damit zur Organisation des Zytoskeletts und zur Zellmorphologie beiträgt. TPPP ist in Oligodendrozyten angereichert und wird mit der Bildung und Aufrechterhaltung der Myelinscheide in Verbindung gebracht, was es mit Prozessen verknüpft, die Mikrotubulidynamik, intrazellulären Transport und Differenzierungsprogramme im Nervensystem koordinieren. Eine dysregulierte TPPP-Expression oder Aggregation wurde in Kontexten berichtet, die mit Neurodegeneration in Zusammenhang stehen, wobei eine veränderte Zytoskelettstabilität und Proteinhomöostase neuronale und gliale Funktionen beeinträchtigen können. Diese Eigenschaften machen TPPP zu einem nützlichen Ziel, um Mikrotubuli-Remodelling, Oligodendrozytenbiologie und Mechanismen zu untersuchen, die die Regulation des Zytoskeletts mit neurologischen Krankheitsphänotypen verbinden.

TPPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPPP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TPPP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPPP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPPP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TPPP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPPP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TPPP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TPPP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPPP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.