TPPII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403717-ACT

Il gene umano **TPP2** codifica la tripeptidil peptidasi II (TPPII), una grande esopeptidasi serinica citosolica che rifinisce gli oligopeptidi generati dal sistema ubiquitina–proteasoma e sostiene il controllo qualità delle proteine e il turnover dei peptidi intracellulari. Regolando la processazione dei peptidi, TPPII influenza la proteostasi, la disponibilità di peptidi antigenici per la presentazione tramite MHC di classe I e le vie di adattamento allo stress collegate alla sopravvivenza cellulare e all’apoptosi. Un’alterata attività di TPP2/TPPII è stata associata a una proteolisi deregolata e a fenotipi immuno-correlati, rendendola rilevante per studi meccanicistici sulla compensazione del proteasoma, sulla segnalazione infiammatoria e sulle transizioni di stato cellulare in condizioni di stress proteotossico. TPP2 è quindi un nodo utile per analizzare come le peptidasi citosoliche modellino le vie di degradazione proteica e le risposte cellulari a valle in sistemi modello umani.

TPPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TPPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TPPII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TPPII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TPPII nelle cellule tumorali con espressione di TPP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.