TopBP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402703-ACT

Humanes TOPBP1 kodiert TopBP1, ein essenzielles Scaffold-Protein für die Genomstabilität, das die Initiation der DNA-Replikation und die ATR-abhängige Replikationsstressantwort koordiniert. TopBP1 fördert die Aktivierung von ATR durch Interaktion mit ATRIP und ist an Checkpoint-Signalgebung, Stabilisierung von Replikationsgabeln und der Wahl von Reparaturwegen während der S-Phase und als Antwort auf DNA-Schäden beteiligt. Über seine BRCT-Domänen organisiert es Multiproteinkomplexe an gestoppten Replikationsgabeln und an geschädigtem Chromatin und verknüpft so das Replikationstiming mit der Checkpoint-Kontrolle. Eine dysregulierte TOPBP1-Expression oder -Funktion wurde mit erhöhtem Replikationsstress, chromosomaler Instabilität und krebsassoziierten Defekten der genomischen Aufrechterhaltung in Verbindung gebracht.

TopBP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOPBP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TopBP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOPBP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOPBP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TopBP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOPBP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TopBP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TopBP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOPBP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.