Plásmido CRISPR de Activación (h) TNAP: sc-400784-ACT

ALPL codifica la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP), una ectoenzima anclada por glicosilfosfatidilinositol que hidroliza monoésteres de fosfato extracelulares para regular el equilibrio entre fosfato inorgánico y pirofosfato. Al controlar la disponibilidad de pirofosfato y generar fosfato para la formación de hidroxiapatita, la TNAP es un regulador central de los programas de mineralización y de la diferenciación de osteoblastos, y se conecta con la señalización purinérgica mediante el metabolismo de nucleótidos como el ATP. La actividad de la TNAP también influye en la composición de la matriz extracelular y en la propensión a la calcificación tanto en el tejido óseo como en el vascular. La disfunción de ALPL/TNAP se asocia con depósito mineral anómalo y fenotipos esqueléticos, por lo que es relevante para estudios de biología ósea, vías de calcificación y homeostasis del fosfato.

TNAP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ALPL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TNAP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ALPL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ALPL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TNAP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ALPL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TNAP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TNAP en células tumorales con expresión de ALPL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.