Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEM192: sc-415021-ACT

Le gène humain **TMEM192** code une protéine transmembranaire associée aux lysosomes, impliquée dans l’organisation endolysosomale et le trafic vésiculaire. Sa localisation aux membranes lysosomales étaye des rôles dans l’intégrité des lysosomes, le traitement des cargos et la coordination des voies autophagie–lysosome qui maintiennent la protéostasie cellulaire. Comme la fonction lysosomale influence la signalisation de l’immunité innée, l’adaptation métabolique et les réponses au stress, une activité altérée de TMEM192 est pertinente pour la recherche sur la neurodégénérescence, la survie des cellules cancéreuses et des phénotypes inflammatoires, où les processus dépendants des lysosomes sont fréquemment perturbés. La modulation de l’expression de TMEM192 constitue une approche accessible pour étudier la régulation, centrée sur les lysosomes, des voies de dégradation et les interconnexions de signalisation.

TMEM192 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM192 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEM192 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM192 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM192, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEM192. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM192 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEM192 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEM192 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM192 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.