TMEM192 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415021-ACT

Humanes TMEM192 kodiert ein lysosomenassoziiertes Transmembranprotein, das an der endolysosomalen Organisation und dem vesikulären Transport beteiligt ist. Seine Lokalisation in lysosomalen Membranen unterstützt Funktionen bei der Aufrechterhaltung der Lysosomenintegrität, der Verarbeitung von Fracht sowie der Koordination von Autophagie‑Lysosom‑Signalwegen, die die zelluläre Proteostase sichern. Da die lysosomale Funktion die angeborene Immun-Signalgebung, metabolische Anpassung und Stressantworten beeinflusst, ist eine veränderte TMEM192-Aktivität relevant für die Forschung zu Neurodegeneration, Überleben von Krebszellen und inflammatorischen Phänotypen, bei denen lysosomenabhängige Prozesse häufig gestört sind. Die Modulation der TMEM192-Expression bietet einen gut handhabbaren Ansatz, um die lysosomenzentrierte Regulation von Abbauwegen und die Signalweg‑Wechselwirkungen zu untersuchen.

TMEM192 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM192-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM192 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM192-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM192-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM192-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM192-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM192-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM192-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM192-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.