Titin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402827-ACT

Das humane Gen **TTN** kodiert **Titin**, ein riesiges sarkomerisches Protein, das sich von der **Z-Scheibe** bis zur **M-Linie** erstreckt und als molekulares Gerüst und Feder wirkt, um die Integrität der Myofibrillen, die passive Elastizität und die Kraftübertragung in quergestreifter Muskulatur aufrechtzuerhalten. Titin koordiniert den Aufbau des Sarkomers durch Wechselwirkungen mit Aktin, Myosin sowie Z-Scheiben-/M-Linien-Komplexen und trägt zu Mechanosensorik-Prozessen bei, die Dehnung mit dem Umbau des kontraktilen Apparats koppeln. Die TTN-Aktivität ist in Signalwege der strukturellen Muskelhomöostase eingebunden, darunter Zytoskelettorganisation, Proteinhomöostase/Proteinqualitätskontrolle und stressresponsive Signalgebung, die die Funktion von Kardiomyozyten und Skelettmuskelfasern prägt. Genetische Varianten und eine Fehlregulation von TTN sind stark mit Muskelkrankheitsphänotypen assoziiert, wodurch TTN ein zentrales Gen für die Untersuchung der Sarkomerbiologie und von Genotyp–Funktions-Beziehungen in humanen Modellen darstellt.

Titin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TTN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Titin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TTN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TTN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Titin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TTN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Titin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Titin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TTN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.