Plasmide CRISPR d'Activation (h) TFIID/TATA Binding Protein/TBP: sc-400579-ACT

TBP code pour la protéine de liaison à la boîte TATA (TATA-binding protein), un composant central conservé du complexe TFIID qui reconnaît des éléments du promoteur et amorce l’assemblage du complexe de pré‑initiation de l’ARN polymérase II. En se liant à la boîte TATA et en coordonnant le recrutement des facteurs généraux de transcription, TBP soutient la transcription basale et influence la sélection des promoteurs, l’engagement de la chromatine et la dynamique d’initiation transcriptionnelle. TBP contribue également à des programmes de transcription pilotés par les polymérases I et III, ce qui l’associe à la biogenèse des ribosomes, à la synthèse des ARNt et à la protéostasie globale. Une altération du dosage de TBP ou une perturbation de sa fonction a été associée à une dérégulation de l’expression génique et à des phénotypes neurodégénératifs, ce qui en fait un nœud utile pour étudier l’homéostasie transcriptionnelle dans des modèles pertinents pour les maladies.

TFIID/TATA Binding Protein/TBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TFIID/TATA Binding Protein/TBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TFIID/TATA Binding Protein/TBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TFIID/TATA Binding Protein/TBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TFIID/TATA Binding Protein/TBP dans les cellules tumorales présentant une expression de TBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.