TCP-1 η CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403833-ACT

CCT7 kodiert die TCP-1-η-(CCTη)-Untereinheit des zytosolischen Chaperonins, das den TCP-1-(CCT/TRiC)-Komplex enthält – eine ATP-abhängige Faltungsmaschinerie, die für die Reifung strukturell komplexer Proteine wie Aktin und Tubulin erforderlich ist. Durch die Unterstützung von Zytoskelettaufbau, Proteostase und Qualitätskontrolle beeinflusst CCT/TRiC die Progression des Zellzyklus, den intrazellulären Transport und Stressantworten, einschließlich des Crosstalks mit Ubiquitin-Proteasom-Wegen. Eine fehlregulierte Chaperonin-Aktivität wurde mit veränderten Programmen der Protein-Homöostase in proliferativen und neurodegenerativen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, wodurch CCT7 ein nützlicher Ansatzpunkt ist, um faltungsabhängige Phänotypen zu untersuchen. In menschlichen Zellen kann eine Störung der CCT7-Expression aufzeigen, wie die Chaperon-Kapazität die Zytoskelettdynamik und Signalnetzwerke begrenzt, die auf korrekt gefaltete Client-Proteine angewiesen sind.

TCP-1 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCT7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCP-1 η Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCT7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCT7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCP-1 η-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCT7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCP-1 η-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCP-1 η-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCT7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.