Plasmide CRISPR d'Activation (h) TCP-1 ε: sc-402993-ACT

CCT5 code la sous-unité humaine TCP-1 ε du complexe chaperonine TRiC/CCT, une machine de repliement dépendante de l’ATP qui favorise la maturation des protéines naissantes et des protéines dénaturées par le stress dans le cytosol. TRiC soutient la protéostasie en aidant au repliement de substrats clés, notamment l’actine et la tubuline, influençant ainsi l’organisation du cytosquelette, le trafic vésiculaire et la progression du cycle cellulaire. Une perturbation de la capacité des chaperonines peut modifier la stabilité du protéome et les réponses au stress, reliant la fonction de CCT5/TCP-1 ε à des voies qui déterminent l’aptitude cellulaire en conditions protéotoxiques. Une activité chaperonique dérégulée et des réseaux de repliement altérés sont fréquemment étudiés dans le contexte de la neurodégénérescence et de la biologie du cancer, en tant que facteurs contribuant à l’agrégation protéique, au déséquilibre des voies de signalisation et à des programmes de prolifération modifiés.

TCP-1 ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCT5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TCP-1 ε Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCT5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCT5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TCP-1 ε. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCT5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TCP-1 ε au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TCP-1 ε dans les cellules tumorales présentant une expression de CCT5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.