TBK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401066-ACT

Humanes TBK1 (TANK-binding kinase 1) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die angeborene Immun- und Stress-Signalwege integriert und nachgeschaltet an Mustererkennungsrezeptoren über die Phosphorylierung von IRF3/IRF7 Typ-I-Interferonantworten auslöst. TBK1 moduliert zudem die NF-κB-Signalisierung und reguliert selektive Autophagie und Mitophagie durch Phosphorylierung von Autophagie-Rezeptoren wie OPTN und p62/SQSTM1, wodurch inflammatorische Signalgebung mit der zellulären Qualitätskontrolle verknüpft wird. Eine fehlregulierte TBK1-Aktivität wird mit chronisch entzündlichen Phänotypen und neurodegenerativen Prozessen in Verbindung gebracht; außerdem werden Loss-of-Function-Varianten von TBK1 über beeinträchtigte Autophagie und veränderte Immunsignalgebung mit einem erhöhten ALS/FTD-Risiko assoziiert. Diese Eigenschaften machen TBK1 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der cGAS–STING-Signalgebung, antiviraler Antworten und der autophagieassoziierten Proteostase in humanen Zellmodellen.

TBK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.