TBC1D24 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404561-ACT

TBC1D24 kodiert ein TBC-Domänen-haltiges Protein, das an der Regulation des Membrantransports und der Vesikeldynamik beteiligt ist – Prozesse, die die synaptische Funktion und andere stark beanspruchte sekretorische Signalwege unterstützen. Obwohl seine TBC-Domäne im Vergleich zu kanonischen Rab-GTPase-aktivierenden Proteinen atypisch ist, wird TBC1D24 mit der Kontrolle der endosomalen Sortierung, dem Recycling synaptischer Vesikel und der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase unter oxidativem Stress in Verbindung gebracht. In Neuronen greifen diese Signalwege in aktivitätsabhängige Signalübertragung und den Turnover von Organellen ein, die die Erregbarkeit und die Stabilität neuronaler Netzwerke beeinflussen. Genetische Variationen in TBC1D24 sind mit neuroentwicklungsbedingten und epileptischen Phänotypen assoziiert, was mechanistische Untersuchungen dosis- und kontextabhängiger Effekte in geeigneten zellulären Modellen nahelegt.

TBC1D24 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBC1D24-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBC1D24 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBC1D24-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBC1D24-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBC1D24-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBC1D24-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBC1D24-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBC1D24-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBC1D24-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.