Plasmide CRISPR d'Activation (h) T-type Ca⁺⁺ CP α1H: sc-401147-ACT

CACNA1H code la sous-unité α1H, constitutive du pore, du canal calcique de type T CaV3.2 dépendant du voltage. Ce canal médie une entrée de Ca2+ activée à faible dépolarisation, qui module l’excitabilité sous-liminaire, les décharges en bouffées rythmiques et la signalisation intracellulaire dépendante du calcium. En couplant la dépolarisation membranaire à des voies régulées par le Ca2+, CaV3.2 influence la libération de neurotransmetteurs, la sécrétion hormonale et des programmes de transcription dépendants du calcium dans des tissus excitables et non excitables. Une expression anormale de CACNA1H ou une activité altérée du canal a été impliquée dans des troubles associés à une perturbation de la signalisation électrique et de l’homéostasie du calcium, notamment des phénotypes du spectre épileptique, la sensibilisation à la douleur et des troubles du rythme cardiaque. En tant que nœud au sein des réseaux de signalisation calcique, CACNA1H est fréquemment étudié pour sa contribution à l’excitabilité, à la régulation génique dépendante du Ca2+ et au couplage stimulus–réponse.

T-type Ca++ CP α1H Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA1H sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

T-type Ca++ CP α1H Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA1H dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA1H, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de T-type Ca++ CP α1H. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA1H natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de T-type Ca++ CP α1H au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie T-type Ca++ CP α1H dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA1H silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.